26. apríla 1986 bolo naplánované odstavenie reaktora číslo 4 kvôli pravidelnej údržbe. Bolo rozhodnuté využiť túto príležitosť na otestovanie schopnosti turbogenerátora reaktora vyrábať dostatočné množstvo elektriny na napájanie bezpečnostných systémov reaktora (predovšetkým vodných čerpadiel) v prípade súčasného výpadku energie z reaktora a vonkajších zdrojov elektrickej energie. Konštruktéri elektrárne počítali s tým, že v takom prípade by mala roztočená turbína poskytnúť dostatok energie potrebnej pre bezpečné odstavenie reaktora. K vyskúšaniu, či je to skutočne tak, malo pôvodne dôjsť ešte pred spustením reaktora, ale politický tlak na rýchle uvedenie elektrárne do činnosti spôsobil, že celá séria prevádzkových testov bola odložená.

Podľa plánu experimentu mal byť reaktor použitý na roztočenie turbíny, potom mala byť turbína od reaktora odpojená a mala sa ďalej točiť len vlastnou zotrvačnosťou. Výstupný výkon reaktora bol znížený z normálnej kapacity 3,2 GW na 700 MW, aby test prebiehal pri bezpečnejšom, nízkom výkone. Počas zdržania na začiatku experimentu však operátori znížili výkon príliš a skutočný výstupný výkon klesol až na 30 MW. Následkom toho sa zvýšila koncentrácia xenónu-135, ktorý je produktom jadrovej reakcie a pohlcuje neutróny; tento produkt by sa normálne pri vyšších hodnotách výkonu v reaktore hneď premieňal ďalej. Aj keď sa úbytok výkonu povážlivo priblížil k bezpečnostnej medzi, posádka sa rozhodla nezastaviť reaktor a pokračovať v experimente. Navyše sa rozhodla „skrátiť“ experiment a zvýšiť výstupný výkon, aj keď len na 200 MW. Kvôli nadbytku xenónu-135 pohlcujúceho neutróny boli regulačné tyče vysunuté z reaktora o niečo viac, než by bolo pri normálnom bezpečnom riadení prípustné. Ako súčasť experimentu boli 26. apríla o 1:05 spustené vodné čerpadlá poháňané turbogenerátorom; takto vytvorený prietok vody prekročil medze stanovené bezpečnou reguláciou. Prietok vody sa ešte zvýšil o 1:19; a pretože voda tiež pohlcuje neutróny, toto ďalšie zvýšenie prietoku vody si vynútilo dokonca vytiahnutie aj ručne ovládaných regulačných tyčí, čo vytvorilo vysoko nestabilné a nebezpečné prevádzkové podmienky.

O 1:23:04 sa začal experiment. Nestabilný stav reaktora sa nijako neprejavil na kontrolnom paneli a nezdalo sa, že by sa ktokoľvek z obsluhy reaktora obával nebezpečenstva. Prívod elektriny do vodných čerpadiel bol vypnutý a pretože ich poháňal turbogenerátor iba zotrvačnosťou, prietok vody sa zmenšoval. Turbína bola odpojená od reaktora a tlak pary v jadre reaktora sa zvyšoval. Postupne ako sa chladiaca kvapalina zahrievala, v jej potrubí sa začali vytvárať vrecká pary. Konštrukcia grafitom moderovaného reaktora typu RBMK v Černobyle sa vyznačuje veľkým pozitívnym dutinovím koeficientom, čo znamená, že za neprítomnosti vody, ktorá pohlcuje neutróny, sa výkon reaktora prudko zvyšuje a reaktor sa postupne stáva stále nestabilnejším a nebezpečnejším. O 1:23:40 stlačili operátori tlačidlo „AZ5“ (аварийная защита – havarijná ochrana), ktoré znamená rýchle odstavenie reaktora – kompletné zasunutie všetkých regulačných tyčí, vrátane ručne ovládaných tyčí, ktoré boli predtým neobozretne vytiahnuté. Nie je jasné, či išlo o núdzové opatrenie, alebo či to bol rutinný krok zastavenia reaktora po skončení experimentu (bolo naplánované zastavenie reaktora pre pravidelnú údržbu). Zvyčajne sa predpokladá, že rýchle odstavenie bolo spustené ako odpoveď na neočakávané prudké zvýšenie výkonu. Naproti tomu, Anatolij Stepanovič Djatlov, prevádzkový zástupca hlavného inžiniera Černobyľskej jadrovej elektrárne, napísal vo svojej knihe:

Pred 01:23:40 systém centrálnej kontroly… nezaregistroval žiadne zmeny parametrov, ktoré mohli ospravedlniť rýchle odstavenie. Komisia… nazhromaždila a analyzovala veľké množstvo materiálov a, ako sa vyslovila vo svojej správe, nemohla nájsť dôvod, prečo bolo rýchle odstavenie spustené. Nie je potrebné hľadať dôvod. Reaktor bol po skončení experimentu jednoducho odstavený.

Kvôli pomalému mechanizmu vsúvania regulačných tyčí (18 – 20 s do skončenia operácie), prázdnym koncom tyčí a dočasnému nedostatku chladiacej kvapaliny, spôsobilo rýchle odstavenie zvýšenú reakčnosť. Zvýšená výstupná energia spôsobila deformáciu kanálov regulačných tyčí. Tyče sa zasekli potom, ako boli zasunuté do jednej tretiny a neboli preto schopné zastaviť reakciu. O 1:23:47 vyskočil výkon reaktora na asi 30 GW, desaťkrát viac ako normálny prevádzkový výstup. Palivové tyče sa začali taviť a prudko zvýšený tlak pary spôsobil veľkú parnú explóziu, ktorá odhodila a zničila kryt reaktora, potrhala chladiace potrubie a vyrazila dieru do stropu.

Kvôli zníženiu nákladov pri veľkej veľkosti reaktora umožňovala konštrukcia reaktorovej budovy iba čiastočné zadržanie rádioaktívnych splodín. To dovolilo rádioaktívnej kontaminácii uniknúť do atmosféry hneď potom, ako parná explózia spôsobila puknutie primárnej tlakovej nádrže. Len čo bola odhodená časť strechy, spôsobil prísun kyslíka kombinovaný s extrémne vysokou teplotou paliva a grafitového moderátora reaktora horenie grafitu. Tento požiar veľkou mierou prispel k rozptýleniu rádioaktívneho materiálu a celkovej kontaminácií vonkajších oblastí.

Existujú spory ohľadom presného poradia udalostí po 1:22:30 miestneho času, vďaka nezrovnalostiam medzi správami očitých svedkov a záznamami z elektrárne. Najčastejšie prijímaná verzia bola už popísaná vyššie. Podľa tejto teórie nastala prvá explózia asi o 1:23:47, 7 sekúnd potom, ako operátori spustili „rýchle odstavenie“. Niekedy sa tvrdí, že explózia sa stala „skôr“ alebo že nasledovala okamžite po aktivácii havarijnej ochrany (to bola pracovná verzia sovietskej komisie študujúcej haváriu). Rozdiel je dôležitý, pretože, pokiaľ by sa reaktor dostal do kritického stavu niekoľko sekúnd po spustení rýchleho odstavenia, jeho zlyhanie sa musí pripísať zlej konštrukcii regulačných tyčí, naproti tomu explózia v okamihu spustenia rýchleho odstavenia by skôr ukazovala na chybu operátorov. V čase 1:23:39 bola v oblasti Černobyľa skutočne zaznamenaná slabá seizmická udalosť podobná zemetraseniu s magnitúdou 2,5. Táto udalosť mohla byť spôsobená explóziou alebo mohlo ísť len o náhodnú zhodu okolností. Situáciu komplikuje fakt, že tlačidlo „AZ“ bolo stlačené viac ako raz a osoba, ktorá ho stlačila, zomrela dva týždne po havárii na následky rádioaktívneho ožiarenia.